实验准备：wako质谱级赖氨酰肽链内切酶125-05061

单位定义

wako质谱级赖氨酰肽链内切酶125-05061的酰胺酶单位定义为在30℃、pH 9.5条件下，每分钟生成1μmol对硝基苯胺所需的酶量。单位计算公式为：
AU/vial=[(a-b)/25] × (1/962) × (40/01)
其中，a代表检测样品中的吸光度，b为空白对照的吸光度。

实验操作流程

为了避免捕获任何蛋白质，建议使用聚硅酮处理的微量离心管和吸管。对于质谱分析，可以选择质谱分析专用的凝胶染色试剂盒，例如银染剂MS试剂盒（产品编号：299-58901）和负凝胶染色MS试剂盒（产品编号：293-57701）。实验步骤如下：

1. 电泳分离蛋白质样品。
2. 从凝胶中切割蛋白质片段，并放入微量离心管中。
3. 使用脱色溶液脱色凝胶。
4. 向试管中加入300μL乙腈，搅拌器震荡30分钟。
5. 去除乙腈，用Parafilm膜封住微量离心管。
6. 在Parafilm膜上打出针孔，进行真空干燥15分钟。
7. 将100μL 10mmol/L DTT溶解于100mmol/L碳酸氢铵中，并在56℃下恒温1小时。
8. 室温冷却后，加入等量的50mM碘乙酰胺溶解于100mmol/L碳酸氢铵，暗处恒温45分钟并涡旋。
9. 用100μL 100mmol/L碳酸氢铵洗涤凝胶片段10分钟。
10. 用300μL乙腈干燥凝胶片段15分钟。
11. 用100μL 100mmol/L碳酸氢铵进行凝胶片段的胀化15分钟。
12. 再次用300μL乙腈干燥凝胶片段15分钟。
13. 去除液相，继续真空干燥凝胶片段15分钟。
14. 使用100μL赖氨酸内切酶溶液在冰水浴中溶胀凝胶片段45分钟。
15. 移除100μL赖氨酸内切酶溶液，将凝胶片段放置于37℃、10μL 50mmol/L Tris-HCl (pH 8.5)中过夜。
16. 加入50μL 20mmol/L碳酸氢铵，并在20分钟内搅拌凝胶片段，提取多肽3次。
17. 用5%甲酸/50%乙腈在20分钟内搅拌凝胶片段，再次提取多肽3次。
18. 如有需要，可使用SpeedVac浓缩多肽。
19. 使用ZipTip进行多肽脱盐和纯化。
20. 如需要，可以弱真空浓缩多肽至2μL。
21. 最后，添加基质进行质谱分析。

购买渠道

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