冻存原理

当细胞温度低于0°C时，会发生脱水现象，细胞内可溶性物质浓度升高，并可能形成冰晶。冰晶的大小差异会对细胞造成不同影响，大型冰晶容易导致细胞膜及细胞器的损伤和破裂，从而影响复苏后细胞的存活率和状态。因此，在进行细胞冻存时，我们采取了两项重要措施：加入低温保护剂，并采取慢冻法处理细胞。

冻存时机

适合冻存的细胞应处于生长良好状态，密度约为80-90%，数量一般应在10⁶-10⁷/ml。较差活力的细胞在冻存后的存活率较低，不宜冻存。

低温保护剂

常用的低温保护剂为二甲基亚砜（DMSO），它是一种有效的渗透保护剂。DMSO能迅速进入细胞，提高细胞膜的水通透性，降低冰点，并延缓冻结过程，使细胞内的水分在冻结前排出细胞外，在胞外形成冰晶，从而减少胞内冰晶的产生，降低冰晶对细胞的损伤。

慢冻细胞方法

使用程序性降温盒可以缓慢冻存细胞，避免大冰晶的产生。如果没有程序降温设备，可将细胞依次在4°C保存1小时、-20°C保存2小时及-80°C过夜，大部分细胞能够适应这一过程。

冻存液配置

冻存液应提前调配，并存放在室温中，以避免临时配制产生的热量损伤细胞（DMSO加入培养基会释放热量）。常规冻存液配比为培养基：血清：DMSO=7:2:1。如果细胞较为珍贵，可以调整为血清：DMSO=9:1。

操作步骤

1. 使用移液器吸走原培养基，加入适量PBS洗涤1-2遍。
2. 消化细胞：加入适量胰酶，置于培养箱中37°C消化（在10厘米的培养皿中加入1ml 0.25%的胰酶，消化4-5分钟，观察细胞是否变圆，终止消化的标准为80%-90%以上的细胞变圆）。
3. 消化完成后，加入体积为胰酶两倍的完全培养基以终止消化，然后以800-1000rpm离心3-5分钟。
4. 准备冻存管，并标记日期、细胞类别、人员姓名及代数，待细胞离心后去上清，加入冻存液重悬，每管1-1.5ml，转移到冻存管中。
5. 将冻存管放入程序降温盒中，-80°C保存过夜，然后转移到液氮中保存。

注意事项

• 细胞加入冻存液后应立即放入-80°C保存，避免常温放置过久。
• 在-80°C中储存的冻存细胞通常不建议超过半年，而在液氮中一般不建议超过2年。

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